Ty thể là bào quan có mặt trong hầu hết các tế bào nhân chuẩn với chức năng chính là sản xuất năng lượng dưới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào. Hệ gen ty thể có cấu trúc sợi đôi, DNA mạch vòng với kích thước 16.569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome (rRNA). Gần như tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào, mô và tổ chức khác nhau chủ yếu tập trung ở cơ, thần kinh và chức năng chuyển hóa của cơ thể (Mishra and Chan, 2014). 

Giống như tất cả DNA ngoài nhân, phần lớn mtDNA được di truyền theo mẹ (chiếm khoảng 2/3 bệnh liên quan mtDNA) (Chinnery 2002). Tuy nhiên, tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con lại khác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thay đổi về tần suất đột biến. Vì vậy, mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các người con khác nhau có thể rất khác nhau. Các tế bào thường chứa nhiều bản sao mtDNA, vì vậy, khi xuất hiện đột biến thì trong cùng một tế bào có thể có cả mtDNA bình thường và mtDNA đột biến. Đặc điểm này được gọi là tính không đồng nhất (heteroplasmy) của mtDNA, còn nếu tất cả các bản sao của mtDNA giống nhau thì gọi là tính đồng nhất (homoplasmy) (Shanske et al. 2004; Koenig 2008). Hiện nay, hơn 300 đột biến trong hệ gen ty thể người đã được phát hiện, trong đó có hơn 200 đột biến gây bệnh, chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh, chức năng chuyển hoá của cơ thể (Zhuo et al. 2010). Mặt khác, bệnh do đột biến gen ty thể có tác động lâm sàng phức tạp nên rất khó để phát hiện thông qua việc chẩn đoán lâm sàng. Cho đến nay, phân tích DNA là phương pháp hiện đại nhất cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến điểm gây bệnh. Đột biến mtDNA có khả năng gây bệnh tập trung vào 2 nhóm: sắp xếp lại mtDNA (chủ yếu là mất đoạn) và đột biến điểm. Do đó cũng có thể chia những bệnh do mtDNA gây ra thành hai dạng chính, đó là các bệnh do sự sắp xếp lại mtDNA và các bệnh do đột biến điểm mtDNA (Chinnery 2002).

Đại học Quốc gia Hà Nội đã cùng phối hợp với Chủ nhiệm đề tài: GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa thực hiện nghiên cứu với mục tiêu: Chế tạo được bộ kit real-time PCR phát hiện và định lượng chính xác 6 loại đột biến gen ty thể thường gặp: A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A giúp hỗ trợ chẩn đoán bệnh ty thể và tư vấn di truyền.

Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã thu được những kết quả như sau: Đề tài đã chế tạo được bộ kit real-time PCR phát hiện và định lượng chính xác 6 loại đột biến gen ty thể thường gặp: A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A cụ thể: 

- Đã tạo được các plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen không có và có đột biến điểm A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A để làm mẫu chứng dương cũng như đường chuẩn trong bộ kit sau này. 

- Đã tạo được hỗn hợp phản ứng master mix cho real-time PCR sử dụng mẫu dò dạng cầu khóa axit nucleic để phát hiện và định lượng đồng thời 6 đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A trong hỗn hợp mẫu chuẩn của từng cặp plasmid mang đoạn gen ty thể có và không có một trong 6 đột biến quan tâm ở nồng độ 106 bản sao/µl với chu kì ngưỡng nằm trong khoảng 16-25 và cường độ huỳnh quang từ 250-2200 RFU. 

- Đã xây dựng được cách thức phát hiện và định lượng 6 đột biến gen ty thể phổ biến là A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C và G11778A trong cùng điều kiện real-time PCR, trong đó việc tạo master mix có vai trò quyết định. Cụ thể maxter mix gồm hỗn hợp 2X (sẵn có Taq DNA polymerase, đệm, dNTP, dUTP, MgCl2, UNG) mua từ hãng Enzynomic với UNG là các yếu tố giúp chống hiện tượng dương tính giả, bổ sung 10 pmol mồi xuôi, 10 pmol mồi ngược, 2 pmol mẫu dò đột biến, 2 pmol mẫu dò không đột biến, bổ sung đệm TE 1X cho đủ thể tích cuối cùng là 15 µl. Phản ứng real-time PCR được thực hiện với chế độ nhiệt: 50 độ C trong 4 phút để uracyl-Nglycosylase (UNG) loại bỏ gốc uracyl ra khỏi các sản phẩm PCR có thể lẫn trong phản ứng, 95 độ C trong 10 phút cho biến tính DNA ban đầu, đồng thời bất hoạt UNG, tiếp theo là 40 chu kì bao gồm 95 độ C trong 15 giây để biến tính DNA, 60 độ C trong 30 giây cho gắn mồi và kéo dài chuỗi. - Master mix khi được bảo quản trong 7 ngày ở 25 độ C hoặc ở 4 độ C trong 20 ngày và 6 tháng ở - 20 độ C vẫn cho kết quả phát hiện và định lượng các đột biến tin cậy. Độ đặc hiệu của master mix là 100% và độ nhạy ≥ 1%. 

- Đã sản xuất được 12 bộ kit real-time PCR phát hiện và định lượng đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A (mỗi đột biến gồm 2 bộ kit và 100 phản ứng/bộ). 6 bộ kit tương ứng với 6 đột biến đã được đóng gói thành 01 bộ kit lớn để phát hiện và định lượng được cả 6 đột biến trong cùng một điều kiện phản ứng và được đặt tên là Mito-6-mutations q.PCR. Bộ kit Mito-6-mutations q.PCR cho phép phát hiện và định lượng 6 đột biến với mẫu chuẩn và mẫu mù cũng như đạt được các tiêu chuẩn cơ sở cho kit real-time PCR, với độ đặc hiệu 100% và độ nhạy 1%.

- Bộ kit Mito-6-mutations q.PCR đã được sử dụng trong phát hiện và định lượng 02 đột biến T8993C và G11778A ở bệnh nhân cùng thành viên gia đình bệnh nhân. Sử dụng bộ kit Mito- 6 mutations q.PCR đã điều tra sự có mặt các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A ở 69 bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể tại Khoa Thần kinh, Bệnh viện Nhi Trung ương và đã phát hiện được 3 trường hợp mang đột biến A3243G chiếm 4,34%, thành viên gia đình của 2 trong số 3 trường hợp bệnh nhân mang đột biến MELAS A3243G được phân tích vfa cho thấy các đột biến này đều được di truyền từ mẹ sang con và tồn tại ở dạng không đồng nhất trong tế bào. Tỷ lệ đột biến có tương quan với biểu hiện lâm sàng của bệnh. Các đột biến còn lại G3380A, A8344G, T8993G, T8993C, G11778A không có mặt trong mẫu máu của 69 bệnh nhân được lựa chọn nghiên cứu.

Có thể tìm đọc báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 15235/2018) tại Cục Thông tin KH&CN Quốc gia.

Đ.T.V (NASTI)