Nghiên cứu metagenome của một số hệ sinh thái mini tiềm năng nhằm khai thác các gen mới mã hóa hệ enzyme chuyển hóa hiệu quả lignocellulose

Trong những năm gần đây, nông nghiệp vẫn đang được nhà nước chú trọng phát triển và đưa máy móc vào cơ giới hóa nông nghiệp, chính sách “dồn điền đổi thửa” để phục vụ cơ giới hóa đã tác động mạnh mẽ đến sản lượng cây nông nghiệp đặc biệt là lúa gạo. Sản phẩm nông nghiệp gia tăng kéo theo phế phụ phẩm nông nghiệp cũng tăng theo. Trước kia, các phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, bẹ ngô… được tái sử dụng. Bẹ ngô được sử dụng làm chất đốt trong gia đình. Rơm và rạ vừa được sử dụng làm chất đốt, vừa được dùng là thức ăn trong chăn nuôi đồng thời cũng được dùng làm nguyên liệu ủ phân hữu cơ… Người nông dân có thể tận dụng nguồn phế phẩm nông nghiệp vào nhiều mục đích khác nhau. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, đời sống ở nông thôn đã được cải thiện rõ rệt, các phế phụ phẩm này đang bị bỏ phí ngoài đồng ruộng, hoặc được đốt bỏ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường sống  và các hoạt động sinh hoạt hàng ngày. Vì vậy nếu kinh tế sinh học ở Việt nam phát triển thì vấn đề ô nhiễm môi trường sẽ được giải quyết và góp phần vào việc phát triển năng lượng bền vững.

Ở nước ta, việc nghiên cứu tìm kiếm nguồn enzyme cellulase cho chuyển hóa sinh khối được bắt đầu từ những năm 80 của thế kỷ trước, tuy nhiên hầu hết các công trình nghiên cứu đều tập trung vào việc phân lập chủng sinh celluase và nghiên cứu hoạt tính sinh học của cellulase từ chủng để có thể ứng dụng enzyme trong nhiều mục đích khác nhau. Enzyme chủ yếu được tập trung đến là nguồn enzyme từ nấm Aspergillus niger, Aspergillus, Trichoderma, Trichoderma reesei 13-16, Actinomyces griseus 17, Aspergillus niger 18, nấm sò Pleurotus saijor-caju19, Basidiomycete 20,21, Bacillus 22,.....

Hơn thế nữa, phức hệ enzyme khai thác được thiếu hẳn các enzyme tham gia thủy phân lignin và ít enzyme tiền xử lý sinh khối như expansin và các enzyme cắt mạch nhánh xylan. Khảo sát các nghiên cứu trên thế giới chúng tôi nhận thấy phức hợp enzyme thủy phân lignocellulose của vi khuẩn trong dạ cỏ dê có chứa nhiều hệ cellulosome làm 5 tăng cường quá trình chuyển hóa enzyme, phức hệ enzyme từ nấm mục trắng có khả năng thủy phân mạnh lignin và các enzyme ở những vùng sinh thái cực đoan như suối nước nóng có khả năng chịu nhiệt cao có nhiều ứng dụng lớn trong một số ngành công nghiệp. Do vậy nhóm nghiên cứu bao gồm Cơ quan chủ quản Viện công nghệ sinh học đã phối hợp cùng Chủ nhiệm đề tài Tiến sĩ Đỗ Thị Huyền thực hiện: “Nghiên cứu metagenome của một số hệ sinh thái mini tiềm năng nhằm khai thác các gen mới mã hóa hệ enzyme chuyển hóa hiệu quả lignocellulose”.

Nhóm nghiên cứu đã hoàn thành tất cả nội dung nghiên cứu của đề tài và thu được các sản phẩm như đã đăng ký trong bản Thuyết minh và trong Hợp đồng. Ngoài ra, một số sản phẩm đạt được ngoài dự kiến.

1. Các hệ mini sinh thái tiềm năng đã được thu thập bao gồm 45 mẫu ở vùng thủy phân lignocellulose mạnh tại vườn quốc gia Cúc Phương, 10 con dê chăn thả ở Ninh Bình, Thanh Hóa, Ba Vì và 14 mẫu ở suối nước nóng Bình Châu và lựa chọn được một mẫu nấm mục trắng Trametes vesicolor có khả năng chuyển hóa lignocellulose mạnh nhất. Vi khuẩn tổng số từ dạ cỏ dê, mẫu đất xung quanh nấm mục trắng và suối nước nóng Bình Châu đã được tách chiết với chất lượng cao và giải trình tự DNA metagenome, mRNA từ mẫu nấm đã được tách chiết và giải trình tự transcriptome. 

2. Dữ liệu giải trình tự DNA metgenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê, đất xung quanh khu nấm mục trắng phân hủy gỗ và suối nước nóng Bình Châu đều có kích thước đạt 8-9 G (đăng ký 2-4 G) và cơ sở dữ liệu cDNA của nấm có kích thước 4,5 G (đăng ký 0,5 G).

3. Tổng số 4725 trình tự mã hóa cho các nhóm enzyme tham gia tiền xử lý sinh khối, cellulase, hemicellulase trong đó có ít nhất 30% gen hoàn thiện. Trong số các trình tự này có khoảng 94% trình tự có độ tương đồng thấp dưới 85%. Số trình tự amino acid suy diễn từ gen có độ tương đồng thấp dưới 65% với trình tự trong NCBI chiếm khoảng 63%.

4. Đã phân lập được 2 gen mới (có độ tương đồng về trình tự nucleotide với trình tự trên ngân hàng gen NCBI dưới 79%) mã hóa licheninase, xylan beta xylosidase từ DNA metagenome của vi khuẩn trong đất. Đã biểu hiện 11 gen mã hóa cho các enzyme khác nhau tham gia trong chuỗi thủy phân lignocellulose và có 6 trình tự được biểu hiện tốt trong E. coli bao gồm gen mã hóa endo glucanase 1 (enzyme kiềm), endoglucanase 2 (enzyme axit) ở suối nước nóng Bình Châu, gen mã hóa expansin, endo xylanase và anpha glucuronidase từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome của vi khuẩn dạ cỏ dê. Ba enzyme đã được nghiên cứu tinh sạch với độ tinh sạch trên 85%. Năm enzyme sau tinh chế đã được kiểm nghiệm độ sạch.

5. Năm enzyme sau khi tinh chế đã được xác định đặc điểm. Các enzyme đều có tính đặc hiệu cơ chất cao trong đó endo xylanase hoạt động ở pH trung tính hơi ngả axit, endoglucanase 2 có hoạt tính tốt ở pH axit, anpha glucuronidase hoạt động tốt ở pH trung tính còn endoglucanase 1, beta glucosidase hoạt động ở pH kiềm. Endo glucanase axit có nhiệt độ tối ưu cao (65 độ C), anpha glucuronidase hoạt động ở nhiệt độ 30 độ C còn các enzyme khác hoạt động ở nhiệt độ ấm. Mecaptoethanol và triton làm tăng hoạt tính anpha glucuronidase, Ca++, Mg++ làm tăng hoạt tính endoglucanse1, Ca++ làm tăng hoạt tính endoglucanase 2, và Ni++ làm tăng hoạt tính beta glucosidase. Các thông số động học của các enzyme đã được nghiên cứu trong đó các enzyme đều có ái lực vừa với cơ chất. Enzyme anpha glucuronidase là enzyme có tốc độ phản ứng mạnh so với các enzyme được thế giới nghiên cứu.

6. Đã đăng được 2 bài báo quốc tế trong hệ thống SCIE và đăng 08 bài báo (sản phẩm vượt) trong nước thuộc tạp chí Y học Việt Nam (2 bài), tạp chí Sinh học (2 bài), tạp chí Công nghệ sinh học (2 bài) và 2 bài trong Hội nghị, 01 giải pháp hữu ích được chấp nhận đơn, tham gia đào tạo 1 tiến sĩ (kết hợp với đối tác Hà Lan), hỗ trợ đào tạo 03 tiến sĩ (sản phẩm vượt) và 1 thạc sĩ.

Có thể tìm đọc báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 15248/2018) tại Cục Thông tin KHCNQG.

Đ.T.V (NASATI)