Tổng hợp và biến tính hạt nanosilica cấu trúc rỗng mang thuốc có khả năng hướng đích và kiểm soát nhả thuốc ứng dụng trong điều trị ung thư

Hệ porous nanosilica (PNS) đầu tiên sẽ được biến tính với cyclodextrin (CD) và polyethylene glycol (PEG) để làm tăng hiệu quả tải thuốc, kéo dài thời gian nhả thuốc, cải thiện sự phân tán, và tăng khả năng thẩm thấu qua màng tế bào. Đối với hệ mang thuốc thứ hai, PNS sẽ được biến tính với heparin và tác nhân hướng đích folate unit (FA) qua cầu disulfide để làm tăng khả năng dẫn thuốc hướng đích và kiểm soát nhả thuốc bên trong nội bào.

Nhằm phát triển hai hệ mang có khả năng hướng đích và kiểm soát nhả thuốc bên trong tế bào qua đó làm giảm các tác dụng phụ của thuốc và tăng hiệu quả trị bệnh. Nhóm nghiên cứu Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàm lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam do TS. Nguyễn Đại Hải làm chủ nhiệm đã thực hiện nghiên cứu đề tài: “Tổng hợp và biến tính hạt nanosilica cấu trúc rỗng mang thuốc có khả năng hướng đích và kiểm soát nhả thuốc ứng dụng trong điều trị ung thư”. 

Sau gần 3 năm (03/2015 đến 12/2017) triển khai thực hiện, các kết quả thu được như sau: 
1. Tổng hợp và đánh giá nano silica xốp (PNS) như là vật liệu nền cho việc tổng hợp hệ mang thuốc nano
Hạt nanosilica được chế tạo bằng phương pháp sol- gel với xúc tác bazơ. Kết quả cho thấy những hạt PNS trên đều có dạng hình cầu, kích thước khá đồng đều, phân tán với phạm vi đường kính 35-60 nm, mẫu gần như vô định hình, chưa kết tinh. Sử dụng phương pháp đo độ hấp phụ Nitơ để xác định khả năng mang thuốc của hạt nano. Hiệu suất nạp của Doxorubicin trong PNS là 13,40% ± 0,37 với lượng Doxorubicin được nạp là 2,23 % ± 0,06. 
Đánh giá hiệu quả nhả thuốc của PNS
Hạt PNS có tốc độ giải phóng thuốc nhanh. Tốc độ nhả thuốc đã là 37% trong ngày đầu tiên và lên tới 64% trong ngày thứ 3. 
Đánh giá khả năng nạp thuốc của PNS khi thay đổi kích thước
Hiệu suất nạp của PNS tăng khi kích thước của hạt tăng. Trở ngại chính của bề mặt các hạt nano silica là hiệu suất tải thấp, khi phân tán vào dung dịch, các phân tử thuốc sẽ bị rò rỉ ra ngoài do không được bảo vệ.  
2. Tổng hợp hệ nano nhả chậm PNSC@APEG kết hợp mang thuốc trị ung thư 5-FU 
Tổng hợp PNSC@APEG
Đã tổng hợp thành công sản phẩm (PNSC@APEG) bằng phân tích cấu trúc 1H-MNR. Đánh giá cấu trúc APEG, PNSC, và PNSC@APEG 
Tỷ lệ số lượng phân tử CD: số lượng đơn vị oligosaccharide là 1:7. 
Theo công thức, hiệu suất tổng hợp theo quy trình đề nghị trong bài luận này là 42%.  
Kết quả phân tích TEM của PNSC@APEG:
Kích thước hạt trung bình của PNSC@APEG là 40-65 nm, kích thước và hình dạng hạt nano không thay đổi nhiều khi các hạt nano được cố định và bao bọc bởi polyme β-CD-PEG. Kết quả trên đã chỉ ra rằng polyme β-CD-PEG liên kết thành công với bề mặt của PNS ở kích thước nano.  
Kết quả phân tích XRD của PNSC@APEG 
Giản đồ nhiễu xạ tia X được đặc trưng bởi một đỉnh nhiễu xạ có độ rộng bán phổ lớn nằm ở giữa 15o và 30o (2θ), chứng tỏ những hạt có kích thước nhỏ và cường độ yếu cho thấy rằng mẫu gần như vô định hình, chưa kết tinh.
Kết quả phân tích BET của PNSC@APEG:
Các hạt PNSC@APEG diện tích bề mặt nhỏ hơn đáng kể và khối lượng hấp phụ thấp hơn PNS. Kết quả này một lần nữa cho thấy PEG và β-CD được cố định thành công, điều này phù hợp với các kết quả TEM.  
Kết quả phân tích FT-IR của PNSC@APEG: 
Phổ FTIR cho thấy những hạt nano silica đều có đỉnh phổ tại số sóng 801 cm-1 và 1100 cm-1 là do mode đối xứng và bất đối xứng của liên kết Si-O-Si.  
3.Tổng hợp hệ nano silica xốp nhả chậm nhạy pH (PNS-GPTMS-Hydrazine) kết hợp mang thuốc trị ung thư Doxorubicin (DOX) 
- Quy trình tổng hợp hệ PNS kết hợp biến tính bề mặt với GPTMS-Hydrazine 
Sự tổng hợp của PNS-GPTMS-Hydrazine là được thực hiện theo hai bước chính: (1) PNSGPTMS được chuẩn bị bằng cách khuấy PNS trong toluene ở nhiệt độ phòng dưới môi trường nitơ trong 30 phút. Sau đó, GPTMS từ từ được đưa vào tiếp tục khuấy trong 12 giờ trong điều kiện nitơ, dialyzed bằng cách lọc qua màng (MWCO 12-14 kDa) trong  H2O trong 3 ngày để loại bỏ toluene. (2) Các thu được PNS-GPTMS đã được giải thể trong deH2O, sau đó được thêm vào giọt vào một hydrazine dung dịch. Phản ứng này được giữ dưới hằng số khuấy, ở nhiệt độ phòng, và trong 12 giờ. Sau đó, dung dịch được dialyzed deH2O bằng cách sử dụng màng thẩm phân (MWCO 12-14 kDa) trong 3 ngày, và cuối cùng đã được đông khô để đạt được PNS-GPTMSHydrazine. 
Quy trình nang hóa thuốc DOX với PNS-GPTMS-Hydrazine 
DOX đã được nạp vào PNS-GPTMS-Hydrazine bằng phương pháp đánh sóng siêu âm. Mẫu là được tinh chế bằng màng thẩm phân (MWCO 3,5 kDa, Spectrum Laboratories, Inc., USA) trong deH2O trong 24 giờ để loại bỏ không đóng gói thuốc và sau đó được đông khô. 
Đánh giá cấu trúc hệ nano PNS-GPTMS-Hydrazine 
+Đánh giá kết quả TEM: GPTMS và PNS-GPTMS-Hydrazine là dạng hình cầu có đường kính 35nm và 45-70 nm tương ứng. Kích thước hạt của PNS-GPTMS và PNS-GPTMS không khác biệt đáng kể và phân phối khá hẹp.  
+Đánh giá kết quả FTIR: Kết quả chứng minh rằng GPTMS được kết hợp với bề mặt của PNS. Hơn nữa, phổ FTIR của PNS-GPTMS-Hydrazine cũng cho thấy những đỉnh peak tương ứng với sự kéo dài hydroxyl (-OH) và amin (-NH) ở nhóm 3400- 3500 cm-1 và 2917 cm-1 của Hydrazine monohydrat. 
+Đánh giá kết quả TGA: Đã khẳng định sự tồn tại của GPTMS trên bề mặt của PNS và cho thấy Hydrazine được liên hợp với PNS-GPTMS bề mặt. 
+Đánh giá kết quả in vitro nhả thuốc chậm của PNS-GPTMS-Hydrazine: Khả năng nhả thuốc của DOX từ PNS-GPTMS-Hydrazine đã được khảo sát trong PBS ở 37°C ở điều kiện pH khác nhau. Trong điều kiện của pH 7,4, PNS Hydrazine cho thấy ổn định lâu dài, phóng thích đến 96 giờ. Tích lũy lượng DOX thải ra trong 2 giờ đầu tiên là khoảng 11% so với 43% DOX nạp vào –GPTMS. 
4. Tổng hợp hệ nano silica xốp nhả chậm nhạy oxi hóa-khử (PNS-GPTMSHydrazine) kết hợp mang thuốc trị ung thư Doxorubicin (DOX) 
Quy trình tổng hợp PNS-SS-A: Quá trình tổng hợp PNS-SS-A tổng hợp có thể được mô tả trong bốn bước: (1) PNS được tổng hợp bằng quá trình sol-gel, trong đó TEOS như là nguồn silic, CTAB là tác nhân, ethanol làm dung môi, nước làm chất phản ứng và amoniac (NH3) dưới dạng thủy phân xúc tác và ngưng tụ TEOS; (2) PNS chức năng amino (PNS-NH2) được điều chế bằng cách khuấy APS và PNS trong toluene ở nhiệt độ phòng trong môi trường nitơ trong 24 giờ; (3) PNSNH2 thu được và EDC được hòa tan trong deH2O khi khuấy trong 10 phút. Sau đó, DTDP trong DMF được thêm vào hỗn hợp và phản ứng được duy trì trong 24 giờ. Sau đó, mẫu được tinh lọc bằng màng thẩm phân (MWCO 6-8 kDa) ở nhiệt độ phòng cho 4 ngày.; (4) PNS-SS-COOH  và A  trong deH2O được trộn trong hỗn hợp , tiếp theo là bổ sung EDC. Các phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, và sau đó được lọc. Mẫu thử đã được quay số ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. và dung dịch đã được làm khô để có được PNS-SS-A.
Việc tổng hợp CD-HPEG được thực hiện trong năm bước: (1) mPEG-NH2 đã được chế tạo bằng cách sử dụng hóa học PNC dưới sự kiểm soát điều kiện nhiệt độ và môi trường chân không; (2) β-CD và 8,2 M NaOH đã được hòa tan trong deH2O theo sự khuấy liên tục trong 10 phút. TsCl trong acetonenitrile đã được thêm vào hỗn hợp. Phản ứng này được duy trì tại 25°C trong 2 giờ và pH của dung dịch được điều chỉnh đến khoảng 8,0. Các sản phẩm rắn sau đó được kết tủa ở 5-8°C trong 24 giờ, đạt được dưới chân không ở nhiệt độ phòng, và sấy khô ở 70°C trong 2-3 ngày; (3) để tổng hợp CD-NH2, CD-OTs được phân tán trong DMF trong điều kiện khuấy, sau đó thêm EDA. Phản ứng được thực hiện ở 75°C trong điều kiện khuấy liên tục và đun sôi trong 24 giờ. Sau đó, hỗn hợp đã được bốc hơi và kết tủa trong aceton nhiều lần. Các sản phẩm rắn được làm khô trong chân không để có được CDNH2; (4) CD-NH2 được liên hợp thành H bằng cách sử dụng hóa học EDC. Ban đầu, H và EDC đã được hòa tan trong deH2O khi khuấy trong 10 phút. Sau đó, giải pháp của CD-NH2 được thêm vào trong hỗn hợp và phản ứng được duy trì trong 24 giờ. Các giải pháp đã được lọc và thẩm tách bởi một màng thẩm tách (MWCO 6-8 kDa) ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày và dung dịch đã được làm khô để lấy CD-H; (5) cả mPEG-NH2 và CD-H được sử dụng với sự hỗ trợ của hóa học EDC để có được CDHPEG. CD-H và EDC được hòa tan trong deH2O trong điều kiện khuấy và mPEG-NH2 sau đó được thêm vào hỗn hợp. Sau 24 giờ, dung dịch được lọc và quay số (MWCO 6-8 kDa) trong 4 ngày. DeH2O đã được thay đổi 5-6 lần mỗi ngày và dung dịch đã được đông khô để thu thập CD-HPEG. 
Đánh giá kết quả phân tích cấu trúc của PNS-SS-A@CD-HPEG:
Bằng phân tích TEM, kích cỡ của PNS và PNS-SS-A @ CD-HPEG lần lượt là khoảng 40-45 nm và 45-50 nm.  Kích cỡ nhỏ của PNS-SS-A @ CD-HPEG sẽ chịu trách nhiệm hiệu quả thẩm thấu và lưu giữ tăng cường (EPR) có hiệu quả cao hơn nồng độ hạt trong mô khối u.  
CD-HPEG được đặc trưng bởi phép phân tích 1H NMR. Sự hiện diện của tất cả các tín hiệu cộng hưởng đã chứng minh CD-HPEG đã được chuẩn bị thành công 
Quan sát phổ IR, ta thấy các dao động ở các số sóng chứng tỏ có nhóm NH2 trong APTES đã gắn thành công. Hạt cũng được tiến hành khảo sát FTIR để có thêm thông tin chính xác về việc gắn thành công APTES đã ngưng tụ lên hạt rỗng. 
Kết quả đánh giá khả năng nhả thuốc chậm của hệ PNS-SS-A@CD-HPEG:  Lượng nạp thuốc DLE và DLC của PNS-SS-A @ CDHPEG lần lượt là 56,2 ± 2,5% và 10,5 ± 2,8%. Kết quả cho thấy việc giải phóng DOX của DOX / PNS-SS-A @ CDHPEG hạt nano có và không có DTT trong khoảng thời gian 96 giờ.
Kiểm tra độc tính tế bào của vật liệu: Cả PNS và PNS đã bị biến tính không cho thấy rõ về độc tính tế bào đối với tế bào HeLa. Gần như 100% tế bào vẫn có thể sống được ở 500 μg / mL mẫu trong 2 ngày, cho thấy rằng chúng tương thích sinh học. Mặt khác, tăng trưởng tế bào đã được ức chế đáng kể khi tế bào được điều trị bằng các hạt nano có chứa DOX. Một độc tính liều phụ thuộc được quan sát thấy khi ủ riêng từng liều DOX, DOX tải nạp trong PNS, và DOX nạp PNS-Cys-Hep với tế bào HeLa. Phần lớn các tế bào HeLa đã chết khi chúng được thử với DOX ở nồng độ 1 μg/mL trong 2 ngày. Sự tương thích sinh học của PNS và độc tính của DOX là phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Khoảng 38% tế bào đã sống sót với nồng độ DOX tương đương là 1 μg/mL. PNS và PNS-Cys-Hep cho thấy không có độc tính đối với tế bào. Như vậy PNS-Cys-Hep có thể được sử dụng an toàn như một phương tiện vận chuyển thuốc cho các ứng dụng in vivo.

Các kết quả được công bố trên một số tạp chí uy tín như Green Process Synth , Materials Science & Engineering, Nanotechno và Tạp chí Hóa học. 

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 14798/2018) tại Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia.
P.T.T (NASATI)