Nghiên cứu sản xuất KIT chẩn đoán bệnh khảm lá virus
Cập nhật vào: Thứ hai - 14/10/2024 13:08 Cỡ chữ
Passiflora mottle virus (PaMoV) là potyvirus mới, gây hiện tượng quả hóa gỗ trên chanh leo dẫn tới năng suất cũng như giá trị sử dụng giảm nghiêm trọng. Đối với các bệnh virus, một trong các chiến lược quan trọng phòng trừ bệnh là phòng chống vector. Tuy nhiên, chiến lược này không hiệu quả đối với các virus truyền theo kiểu không bền vững như potyvirus (tất cả các potyvirus đều truyền qua rệp muội theo kiểu không bền vững). Vì thế, sử dụng giống sạch bệnh và loại bỏ cây bệnh có thể xem là biện pháp quan trọng nhất hiện nay đối với chanh leo tại Việt Nam. Để đáp ứng được yêu cầu này, hiển nhiên, chẩn đoán nhanh và chính xác virus là cần thiết. Do đó, việc tạo ra các kít chẩn đoán ELISA/que thử nhanh giúp chẩn đoán sớm, nhanh, chính xác PaMV (và các potyvirus khác) là nhu cầu cấp thiết nhằm sản xuất chanh leo bền vững tại Việt Nam.
Đó là lý do nhóm nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam do PGS.TS. Đỗ Tấn Dũng dẫn đầu, đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất KIT chẩn đoán bệnh khảm lá virus (Passiflora mottle virus, PaMoV)” vào năm 2020.
Mục tiêu của đề tài là nhằm tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu với Passiflora mottle virus 2; và tạo được kit ELISA và que thử nhanh chẩn đoán bệnh khảm lá chanh leo (Passiflora mottle virus)
Đề tài đã thu được một số kết quả nổi bật như sau:
Thứ nhất là nội dung tạo nguồn kháng nguyên tái tổ hợp của virus PaMoV:
- Cấu trúc biểu hiện gen mã hóa protein vỏ CP của virus PaMoV đã được xây dựng trên vector pET28a và được dòng hóa vào vi khuẩn E. coli chủng Rosetta (DE3).
- Các thí nghiệm biểu hiện gen CP của PaMoV cho thấy chủng Rosetta (DE3) là chủng ký chủ phù hợp để biểu hiện gen này. Các điều kiện tối ưu để biểu hiện gen CP của PaMoV trong chủng Rosseta (DE3) là nhiệt độ 37℃, môi trường LB và nồng độ IPTG từ 0.1- 1 mM.
- Lượng protein CP biểu hiện tinh chiết đạt yêu cầu đề tài: 10.3 mg
Thứ hai là nội dung thử nghiệm tạo kháng thể đặc hiệu virus PaMoV.
- Đã gây miễn dịch thành công thỏ New Zealand dùng protein CP của PaMoV tái tổ tinh sạch làm nguồn kháng nguyên. Các thí nghiệm dot-blot miễn dịch và ELISA cho thấy kháng huyết thanh và kháng thể IgG tinh chiết của thỏ gây miễn dịch có mức độ đặc hiệu và độ nhạy rất cao. Kháng huyết thanh và kháng thể IgG không phản ứng với protein của cây chanh leo khỏe, không phản ứng với BSA và skim milk. Kháng huyết thanh có thể phát hiện PaMoV trong mẫu lá chanh leo khô ở độ hòa loãng ít nhất 5000 lần trong phản ứng ELISA và 32000 lần trong phản ứng dot-blot miễn dịch với giá trị OD>2.
- Lượng kháng huyết thanh PaMoV thu được đạt yêu cầu đề tài (40 mL) và lượng IgG tinh chiết đạt yêu cầu đề tài (11.6 mg) –
Kháng huyết thanh và kháng thể IgG PaMoV cũng nhận biết với hai potyvirus đang gây hại chanh leo tại Việt Nam và có quan hệ gần gũi với PaMoV là TelMV và EAPV-IB. Điều này rất có ý nghĩa trong thực tiễn chẩn đoán bệnh do potyvirus trên chanh leo tại Việt Nam.
- Kỹ thuật sàng lọc mới dựa trên kỹ thuật chọn lọc ScFv ngược Yin-Yang (Lim et al., 2019) và kỹ thuật dòng hóa trực tiếp đoạn ScFv trên vector pSANG14-3F biểu hiện trong E. coli (Martin et al., 2006) đã chứng tỏ hiệu quả và đơn giản trong quá trình chọn lọc các kháng thể ScFv dung hợp enzyme AP đặc hiệu PaMoV. Các thí nghiệm sàng lọc đã xác định được 3 dòng kháng thể đơn dòng ScFv là CP-43 (chọn lọc từ protein CP), Virion-69 và Virion-70 (chọn lọc từ virion được bẫy bằng kháng thể PaMoV) có tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán PaMoV).
Thứ ba về nội dung thử nghiệm tạo KIT chẩn đoán virus PaMoV:
- Kít PTA-ELISA đã được thiết kế và chế tạo sử dụng kháng huyết thanh PaMV được tạo ra từ nghiên cứu này và các vật liệu khác được cung cấp từ thị trường. Kít cho phép phát hiện PaMoV với độ nhạy cao (giá trị OD>2 đối với mẫu cây bệnh), độ đặc hiệu cao (không phản ứng với protein cây khỏe, các protein khóa như BSA, Skim milk với giá trị OD <2), độ chính xác cao, đạt ~ 95 % so với RT-PCR dùng mồi đặc hiệu PaMoV. Lượng kít sản xuất đạt yêu cầu đề tài (10 kít x 500 phản ứng)
- Kít que thử nhanh đã được thiết kế và chế tạo sử dụng IgG thỏ đặc hiệu PaMV, IgY gà đặc hiệu IgG thỏ, hạt nano vàng được tạo ra từ nghiên cứu này và các vật liệu khác được cung cấp từ thị trường. Kít cho phép phát hiện PaMoV với độ đặc hiệu, độ chính xác tương đương kit ELISA, Lượng kít sản xuất đạt yêu cầu đề tài (500 que thử).
Thứ tư về nội dung chuyển giao kỹ thuật chẩn đoán PaMoV:
- Dựa trên kết quả thu được, một Hội nghị tập huấn – chuyển giao kỹ thuật chẩn đoán miễn dịch virus chanh leo gồm PTA-ELISA, DIBA và que thử nhanh đã được tổ chức tại Khoa Nông học cho 20 cán bộ kỹ thuật thuộc 20 cán bộ kỹ thuật thuộc 8 đơn vị quản lý nhà nước về BVTV gồm: 2 Trung tâm BVTV vùng, 3 chi cục BVTV, 1 Chi cục KDTV, 1 Trung tâm Giám định KDTV, 1 Trung tâm KDTV sau nhập khẩu.
- Kết quả kiểm tra PTA-ELISA với kháng huyết thanh PaMoV và RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu potyvirus và 4 cặp mồi đặc hiệu PaMoV, TelMV, EAPV-IB và EAPV-AO trên 102 mẫu cây chanh leo thu năm 2020 tại 11 địa điểm thuộc Đức Trọng - Lâm Đồng, Mộc Châu - Sơn La, Vân Hồ - Sơn La và Quế Phong - Nghệ An cho thấy 55 mẫu nhiễm potyvirus, trong đó 52 mẫu nhiễm PaMoV, 17 mẫu nhiễm TelMV, 47 mẫu nhiễm EAPV-IB và 20 mẫu nhiễm EAPV-AO. Đáng chú ý, kết quả kiểm tra RT-PCR cho thấy nhiễm hỗn hợp potyvirus trên chanh leo tại Việt Nam rất phổ biến.
Thứ năm về các qui trình:
Dựa trên kết quả nghiên cứu, đề tài đã xây dựng được 4 qui trình gồm:
- Quy trình sản xuất kít ELISA chẩn đoán PaMoV (trong đó sản xuất được kháng huyết thanh/kháng thể 1)
- Qui trình sử dụng kít ELISA chẩn đoán PaMoV
- Qui trình sản xuất que thử nhanh chẩn đoán PaMoV (trong đó tự sản xuất được kháng thể 1, kháng thể 2, hạt nano vàng)
- Qui trình sử dụng kit que thử nhanh
Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 20242/2021) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.
N.P.D (NASATI)