Parkinson là một bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến thứ hai sau bệnh Alzheimer đặc trưng bởi sự thoái hóa của các tế bào thần kinh tiết dopamin trên con đường thể vân - liềm đen ở não. Bệnh Parkinson được đặc trưng bởi 3 triệu chứng chủ yếu: run, cứng khớp và di chuyển chậm chạp. Có nhiều phương pháp để điều trị bệnh: điều trị nội khoa, kích thích não bằng các điện cực cấy vào nhân bèo nhạt hoặc nhân dưới đồi nhưng những biện pháp này chỉ làm giảm các triệu chứng của bệnh. Hiện nay, việc ứng dụng công nghệ tế bào gốc vào điều trị bệnh là một phương pháp mang lại nhiều triển vọng mới cho bệnh Parkinson. Phương pháp này được cho rằng có nhiều ưu điểm vượt trội vì nó không chỉ cải thiện được các triệu chứng lâm sàng của bệnh mà còn làm ngừng tiến triển bệnh. Các tế bào gốc ngoại bì thần kinh bào thai khi ghép vào thể vân sẽ biệt hóa thành các tế bào sản xuất dopamin, tạo ra các synap với các tế bào thần kinh của người bệnh.

Trong bệnh Parkinson, nguyên nhân chính là do thiếu hụt các nơron chế tiết dopamin. Các thử nghiệm lâm sàng với việc ghép mô não giữa phôi thai người vào vùng thể vân đã cho thấy việc ghép này có thể làm tái phân bố lại các dây thần kinh ở trong thể vân, có thể khôi phục được việc giải phóng dopamin và ở một số bệnh nhân có cải thiện tốt về mặt lâm sàng. Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng các tế bào có thuộc tính nơron tiết dopamin ở não giữa có thể được tạo ra từ nhiều loại tế bào gốc khác nhau bao gồm cả loại tế bào sinh dưỡng được tái lập trình. Vấn đề khó khăn là thiếu nguồn cung cấp tế bào gốc để tạo ra nguyên bào thần kinh tiết dopamin thích hợp cho việc ghép lại. Vì vậy, làm thế nào để có nguồn nguyên bào thần kinh tiết dopamin để ghép điều trị bệnh Parkinson là một vấn đề quan trọng cần giải quyết.

Những nghiên cứu về bệnh nguyên, các cơ chế bệnh sinh và cách điều trị vẫn còn nhiều hạn chế vì các nhà nghiên cứu không thể tiến hành các thí nghiệm trên người bệnh đang còn sống. Vì vậy, gây bệnh thực nghiệm trên các loài động vật đóng vai trò quan trọng. Ngay từ đầu thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã tiến hành các mô hình gây bệnh thực nghiệm trên động vật bằng cách gây tổn thương cho não bằng nhiệt độ, phẫu thuật, các chất gây độc hệ thần kinh để tìm hiểu tổn thương hệ thần kinh trung ương. Sau đó, có rất nhiều mô hình gây bệnh thực nghiệm Parkinson trên các loài động vật khác nhau (chuột, mèo, linh trưởng, ruồi giấm...) và bằng các phương thức khác nhau nhưng chủ yếu bằng sử dụng các chất gây độc hệ thần kinh và mô hình chuyển gen. Mỗi mô hình gây bệnh có những ưu điểm và nhược điểm tùy thuộc vào mục tiêu nghiên cứu nhưng mô hình gây bệnh bằng chất gây độc hệ thần kinh được cho là mô hình thích hợp nhất cho việc nghiên cứu ứng dụng các biện pháp điều trị can thiệp của bệnh Parkinson.

Để đánh giá được hiệu quả của việc thử nghiệm ghép tế bào gốc điều trị Parkinson chúng ta cần một mô hình gây bệnh giống với diễn biến của bệnh để đánh giá tổn thương cũng như khả năng phục hồi của các tế bào thần kinh tiết dopamin. 6-hydroxydopamin (6-OHDA) là chất gây độc thần kinh được sử dụng trong mô hình gây bệnh Parkinson lần đầu tiên năm 1968 bởi Ungerstedt. Mô hình này sau đó được cải thiện và trở thành mô hình gây bệnh phổ biến nhất trong các nghiên cứu về cơ chế và các phương pháp điều trị bệnh. So với các chất gây độc được sử dụng trong các mô hình gây bệnh thì 6-OHDA có khả năng gây thoái hóa các tế bào thần kinh tiết dopamin từ từ, mô phỏng giống với quá trình diễn biến của bệnh giống như trên người và nó dễ dàng đánh giá các triệu chứng biểu hiện của bệnh khi não của chuột bị tổn thương nên nó được ứng dụng nhiều để nghiên cứu về các phương pháp điều trị.

Với mong muốn sẽ đưa được phương pháp ghép tế bào gốc ngoại bì thần kinh điều trị bệnh Parkinson ở Việt nam, nhóm nghiên cứu do Cơ quan chủ trì Trường Đại học Y Hà Nội phối hợp với Chủ nhiệm đề tài TS. Nguyễn Mạnh Hà cùng thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng qui trình phân lập và nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh từ bào thai động vật và người để điều trị bệnh Parkinson thực nghiệm”. Với mục tiêu: Có được qui trình phân lập, nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh từ bào thai động vật và người để điều trị bệnh Parkinson; Có được qui trình sử dụng tế bào gốc ngoại bì thần kinh từ bào thai động vật và người để điều trị bệnh Parkinson trên thực nghiệm.

Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã thu được những kết quả như sau:

1. Qui trình phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh từ bào thai chuột: Thời gian tối ưu để phân lập các tế bào tiền thân tiết dopamin trên phôi chuột cống trắng phục vụ cho mục đích nghiên cứu là 12,5 đến 13,5 ngày. Tỷ lệ trích thủ thành công mô sàn não giữa ở tuổi phôi này đạt khoảng 90%. Giai đoạn E10.5-11.5 ở phôi chuột cống trắng các tế bào gốc ngoại bì thần kinh tăng sinh và chuyển thành các tế bào tiền thân tiết dopamin tại vùng sàn não giữa. Quá trình các tế bào này dừng phân chia, định hướng phát triển thành các tế bào tiền thân và đi vào biệt hóa thành các nơron tiết dopamin xung quanh thời điểm phôi 13,5 ngày.

2. Qui trình nuôi cấy tăng sinh, định danh tế bào gốc ngoại bì thần kinh từ bào thai chuột:  Mô sàn não giữa phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi là thích hợp để tạo dịch treo tế bào dùng nuôi cấy với tổng số mô sàn não giữa đã được tạo dịch treo để nuôi cấy là 500 mẫu. Tỷ lệ mọc của các mẫu mô là 96,7% trong đó phôi ở giai đoạn E12,5 - E14,5 có tỷ lệ mọc mẫu tốt nhất (100%). Phôi ở giai đoạn E12,5 và E13,5 khi nuôi cấy có mật độ tế bào dầy, trong đó tế bào dạng nơron chiếm rất nhiều. Tế bào dạng trung mô và biểu mô chiếm rải rác. Ở tuổi phôi giai đoạn E12,5 - E13,5, các mẫu dương tính rất nhiều với marker Vimentin và dương tính nhiều với marker TH.

3. Qui trình phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh từ bào thai ngƣời: Tỷ lệ phân lập được các tế bào biểu mô ống thần kinh từ phôi người khoảng 60%, trong đó tuổi phôi thích hợp nhất để phân lập là 6,5 đến 7,5 tuần. Tỷ lệ các tế bào sống sau khi tạo dịch treo là 80%. Số lượng tế bào biểu mô ống thần kinh phân lập được từ một phôi giảm thiểu dao động từ 0,96 x 105 đến 1,08 x 105 tế bào.

4. Qui trình nuôi cấy tăng sinh, định danh tế bào gốc ngoại bì thần kinh từ bào thai người. Sau 7-10 ngày nuôi cấy, các tế bào tăng sinh phủ kín phiến nuôi cấy. Số lượng tế bào thu hoạch được sau lần nuôi cấy đầu tiên ở mỗi phiến đạt khoảng 1,02 x 106 tế bào. Các tế bào trong phiến nuôi cấy mang đặc điểm của nguyên bào thần kinh. Khi nhuộm Cajal II, toàn bộ các tế bào bắt màu nâu đen, tế bào tập trung thành các cụm - dạng nơron‖. Hầu hết các tế bào trong các mẫu nuôi cấy dương tính với marker Vimentin, số lượng tế bào dương tính không có sự khác biệt ở các tuần tuổi 6,5; 7 và 7,5 tuần. Tất cả các mẫu nuôi cấy đều thấy xuất hiện các tế bào dương tính với marker TH, số lượng nơron dương tính với TH tăng dần theo giai đoạn nuôi cấy. Số lượng tế bào dương tính với TH ở ngày 10 sau nuôi cấy trung bình là 119 tế bào trong một giếng nuôi cấy. Bảo quản các tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P0 cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ sống sau rã đông là 64,6%, tỷ lệ mọc khi nuôi cấy của các mẫu sau rã đông ở nhóm P0 là 73,8%.

5. Mô hình gây bệnh Parkinson cho chuột cống trắng. Thể vân nằm trong vùng có tọa độ phía trước bregma 2,8 ± 0,45 mm, phía sau bregma -3,2 ± 0,57 mm. Liềm đen nằm trong vùng có tọa độ phía trước bregma -4,6 ± 0,65mm, phía sau bregma -6,3 ± 0,76 mm. Tỷ lệ gây bệnh Parkinson thành công ở chuột là 73,2%. Ở chuột bị Parkinson thực nghiệm, tổn thương thể vân chủ yếu là giảm các sợi thần kinh và tận cùng thần kinh. Tại liềm đen tổn thương do 6-OHDA gây ra thoái hóa các tế bào thần kinh đặc biệt là tổn thương chọn lọc trên tế bào tiết dopamin: giảm số lượng tế bào bên tiêm 6-OHDA so với bên não lành không tiêm khi nhuộm với marker TH, tỷ lệ suy giảm tế bào tiết dopamin tại liềm đen sau 3 tuần khoảng 67%, đến 5 tuần khoảng 70%.

6. Qui trình ghép tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi để điều trị cho chuột bị gây bệnh Parkinson thực nghiệm. Vị trí tiêm tế bào gốc ngoại bì thần kinh phù hợp có toạ độ tính từ thóp trước (Bregma): ra trước 0mm, sang phải 3mm, sâu 5mm từ màng cứng. Số lượng tế bào gốc ngoại bì thần kinh được tiêm vào chuột bị bệnh Parkinson thực nghiệm là 4x10⁵ tế bào/2,5µl. Sau 3 tuần tiêm tế bào gốc, chuột bị bệnh không có hiện tượng tăng thêm số vòng quay so với trước tiêm. Các tế bào sau khi tiêm vào tồn tại ở thể vân mà không bị thoái hóa, chúng mang các đặc điểm của tế bào gốc và có những tế bào thể hiện đang hoạt động mạnh với ty thể, lưới nội bào có hạt, ribosom phát triển mạnh. Số điểm TH (+) tăng dần theo thời gian sau khi tiêm M-NESc vào thể vân bên phải.

Có thể tìm đọc báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 15860/2019) tại Cục Thông tin KHCNQG.

Đ.T.V (NASATI)