Từ những năm 1995, các nghiên cứu trong nước mới chỉ tập trung vào phân lập và xác định tính chất các enzyme thuộc nhóm thuỷ phân của các chủng vi khuẩn nuôi cấy được từ suối nước nóng Bình Châu, do đó chưa đánh giá được hết tiềm năng của vi sinh vật trong suối nước nóng này.. Bên cạnh đó, do nhiệt độ môi trường của suối nước nóng là cực trị (nhiệt độ cao) hoàn toàn phù hợp với việc sử dụng kỹ thuật metagenomic để phân tích và đánh giá mức độ đa dạng sinh học, đặc biệt là với vi khuẩn, cổ khuẩn và virut. Ngoài ra, các công bố hiện nay về các enzyme bền nhiệt chủ yếu từ các vi sinh vật ưa nhiệt, trong đó có hai P450 bền nhiệt nhất được biết đến đều thuộc nhóm cổ khuẩn, là nhóm vi sinh vật khó có thể thu nhận bằng con đường phân lập ở điều kiện nuôi cấy thông thường trong phòng thí nghiệm hiện nay.

Với mong muốn có những đánh giá đầy đủ và chính xác hơn về đa dạng sinh học của quần xã vi sinh vật cũng như đa dạng về nguồn gen của chúng ở suối nước nóng Bình Châu nhằm xây dựng được cơ sở dữ liệu về DNA metagenome của vi sinh vật ở suối nước nóng Bình Châu, Bà Rịa, Vũng Tùa, Việt Nam; thu nhận được một số cụm gen mã hóa cho cytochrome P450 bền nhiệt từ DNA metagenome của suối nước nóng Bình Châu; xây dựng được hệ thống biểu hiện cytochrome P450 bền nhiệt trong toàn bộ tế bào E. coli đồng thời đánh giá được tính chất của enzyme và chức năng chuyển hóa một số loại cơ chất của các enzyme cytochrome P450 thu nhận được, nhóm nghiên cứu của TS. Nguyễn Kim Thoa, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã đề xuất và được giao thực hiện đề tài: “Phát hiện và đánh giá chức năng của một số gen mã hóa cho cytochrome P450 bền nhiệt từ quần xã vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu, Việt Nam”.

Đề tài đã thực hiện các nghiên cứu tương ứng với các nội dung:

1) Tách chiết DNA metagenome từ mẫu môi trường suối nước nóng Bình Châu (nước, cặn đáy)

- Thu thập các thông tin về suối nước nóng Bình Châu (vị trí địa lý, nồng độ các chất hòa tan, pH, nhiệt độ...);

- Tách DNA metagenome đạt hiệu quả cao (lượng DNA, độ tinh sạch…) từ mẫu nước và mẫu cặn đáy của suối nước nóng Bình Châu;

- Bảo quản nguồn DNA-metagenome.

2) Giải trình tự DNA metagenome của suối nước nóng Bình Châu

- Giải trình tự DNA metagenome của vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu;

- Xử lý số liệu thô từ kết quả đọc trình tự.

- Đánh giá đa dạng sinh học của quần xã vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu;

- Phân tích, thống kê và xây dựng cơ sở dữ liệu từ kết quả giải trình tự DNA metagenome của suối nước nóng Bình Châu liên quan đến các cụm gen mã hóa cho P450.

3) Sàng lọc và biểu hiện một số gen mã hóa cho các P450 bền nhiệt từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu

- Mô hình hóa những protein P450 được mã hóa từ các trình tự gene tinh (clean data) DNAmetagenome suối nước nóng Bình Châu bằng công cụ bioinformatic để lựa chọn các enzyme P450 bền nhiệt tiềm năng;

- Tách dòng gen mã hóa cho một số P450 bền nhiệt tiềm năng;

- Biểu hiện gen mã hóa cho một số P450 bền nhiệt tiềm năng trong tế bào E. coli

- Tinh sạch các protein P450 bền nhiệt tiềm năng;

- Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của P450 tái tổ hợp thu nhận được;

- Xác định độ bền nhiệt và nhiệt độ biến tính toàn phần của P450 tái tổ hợp thu nhận được.

4. Thiết kế hệ thống truyền điện tử cho các P450 bền nhiệt

- Mô hình hóa con đường truyền điện tử cho các P450 bền nhiệt với các hệ enzyme ferredoxin reductase, ferredoxin có sẵn;

 - Đánh giá tính tương thích của P450 bền nhiệt với các hệ enzyme ferredoxin reductase, ferredoxin tuyển chọn từ mô hình ở mức độ in vitro;

 - Thiết kế vector biểu hiện mang 2 gen mã hóa ferredoxin reductase và ferredoxin tuyển chọn;

- Biểu hiện đồng thời P450 bền nhiệt và các enzyme ferredoxin reductase, và ferredoxin trong tế bào E. coli

5) Sàng lọc cơ chất cho các P450 bền nhiệt

- Thiết lập danh sách các nhóm cơ chất chính để sàng lọc cho các P450 bền nhiệt (steroid, axit béo, terpenoid, các hydrocarbon mạch thẳng, mạch vòng…);

- Thiết lập hệ thống sàng lọc nhanh, chính xác các cơ chất được chuyển hóa nhờ các P450 bền nhiệt;

- Phân tích các sản phẩm của quá trình chuyển hóa cơ chất.

6) Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dụng của P450 bền nhiệt

Nghiên cứu được thực hiện tại địa phận của Công ty cổ phần du lịch Sài Gòn – Bình Châu với quy mô 33 ha nằm giữa rừng tràm với những vị trí khu trú các điểm sôi chính. Vị trí lấy mẫu có tọa độ 10^o 36’03.9” Bắc và 107^o 33’30.0” Đông. Mẫu nước thu thập từ suối nước nóng Bình Châu được sử dụng làm nguyên liệu tách DNA metagenome. Kết quả tách chiết DNA metagenome của mẫu nước suối nước nóng Bình Châu có chất lượng tốt, DNA không bị đứt gãy. Nồng độ của mẫu được đo bằng máy quang phổ Nano Drop 1000 đạt 139,3 ng/µl, A260:A280 đạt 1,84 đủ điều kiện cho các nghiên cứu tiếp theo. DNA metagenome của suối nước nóng Bình Châu được gửi đi giải trình tự tại Công ty BGI (Hongkong). Đề tài đã tách chiết được DNA metagenome của khu hệ vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu có chất lượng cao: nồng độ DNA là 139,3 ng/µl, A260:A280 đạt 1,84. Giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu bằng máy giải trình tự gen thế hệ mới Hiseq Illumina thu được bộ dữ liệu sạch 9.4 GB. Xây dựng được bộ cơ sở dữ liệu của những gen liên quan đến họ cytochrome P450 bao gồm 68 gen tiềm năng mã hóa cytochrome P450, trong đó 38 gen hoàn chỉnh, 14 gen thiếu mã mở đầu, 9 gen thiếu mã kết thúc và 7 gen thiếu cả hai đầu. Biểu hiện được gen mã hoá P450-T2 thuộc họ CYP203A1 trong E. coli C43(DE3) đạt nồng độ 541 nmol/L, gen mã hóa P450-T3 thuộc họ CYP109C2 trong E. coli C43(DE3) đạt nồng độ 585 nmol/L. Tinh sạch được enzyme tái tổ hợp bằng hệ thống sắc ký IMAC, enzyme tinh sạch có nồng độ 1120 μmol/L và 1087 μmol/L. Xác định được một số tính chất của P450-T2 tái tổ hợp: pHopt ở 8, Tm ở 56,8^oC ± 0,08 (R2=0.99), T50 của P450-T2 là 50,2 phút ở 50^oC. P450-T2 là enzyme ưa nhiệt. P450-T2 có thể nhận điện tử được từ một số redox partner khác nhau để khởi động chuỗi truyền điện tử bao gồm Adx (4-108)/AdR của người; Fdx2/BmCPR, Fdx3/BmCPR của B. megaterium, arh1/etp1 của nấm men. Phổ cơ chất tiềm năng của P450-T2 là các hợp chất vòng thơm đa dạng, bao gồm: axit caffeic, mimosine, emodin. Tính chất của P450-T3 tái tổ hợp: pHopt ở 7.5, Tm ở 76,2^oC ± 0,06 (R2=0.99), T50 của P450-T3 là 38,7 phút ở 60^oC. P450-T3 là enzyme ưa nhiệt. P450-T3 có thể nhận điện tử được từ một số redox partner khác nhau để khởi động chuỗi truyền điện tử bao gồm Adx (4-108)/AdR của người, arh1/etp1 của nấm men. Phổ cơ chất tiềm năng của P450-T2 là các hợp chất acid béo, bao gồm: embelin, Retinoic acid (all trans), retinoic acid (13-cis), Lauric acid, Palmitic acid. Đặc biệt nó có thể xúc tác chuyển hóa được cả testosterone. Lần đầu tiên có sự phát hiện CYP109C2 có khả năng xúc tác chuyển hóa steroid. Sản phẩm của quá trình chuyển hoá là 16β-hydroxytestosterone và androstenedione.

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 18095/2020) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.

P.T.T (NASATI)