Nghiên cứu chế tạo KÍT chẩn đoán nhanh đồng thời các virus gây bệnh tai xanh (PRRS), dịch tiêu chảy cấp (PED), dịch tả lợn (CSF) và bệnh còi cọc do circo virus (PCV2) bằng kỹ thuật LAMP

Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt (LAMP- Loop mediated isothermal amplification) là kỹ thuật tổng hợp DNA bằng 4 mồi đặc hiệu nhận biết 6 vùng khác biệt trên một gen đích từ một nguồn khuôn duy nhất, tạo nên một dạng sản phẩm DNA có cấu trúc vòm đã được phát triển bởi Notomi và cộng sự. Kỹ thuật này khắc phục sự phụ thuộc vào thiết bị đắt tiền thông qua việc loại bỏ sự luân nhiệt và khuếch đại DNA trong thời gian ngắn. Do có những ưu điểm nói trên LAMP đã trở thành một công cụ để phát hiện nhanh các loại virus và vi khuẩn gây bệnh.

Mặc dù kỹ thuật LAMP có rất nhiều ưu điểm, tuy nhiên vẫn còn rất ít nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này trong phát hiện dịch bệnh ở gia súc, gia cầm tại Việt Nam. Bốn loại virus PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome), CSF (classical swine fever), PED (porcine epidemic diarrhea) và PCV2 (porcine circo virus type 2) đều là những tác nhân gây dịch bệnh quan trọng tác động lớn đến ngành chăn nuôi lợn ở nước ta. Các yếu tố chủ chốt kiểm soát và loại bỏ các tác nhân nói trên bao gồm giám sát và phát hiện dịch sớm, nhận diện nhanh các đàn lợn nhiễm từ đó có những biện pháp dập tắt dịch hiệu quả. Để tiến hành phát hiện sàng lọc bốn loại virus nói trên, ngăn chặn dịch bệnh bùng phát xảy ra ở cấp cơ sở, cần thiết lập một phương pháp phát hiện đơn giản, nhanh và nhạy với yêu cầu trang thiết bị cơ bản. Do đó, nhóm nghiên cứu Viện thú y do TS. Phạm Minh Hằng làm chủ nhiệm đã đề xuất thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế tạo KÍT chẩn đoán nhanh đồng thời các virus gây bệnh tai xanh (PRRS), dịch tiêu chảy cấp (PED), dịch tả lợn (CSF) và bệnh còi cọc do circo virus (PCV2) bằng kỹ thuật LAMP” nhằm chế tạo được KÍT chẩn đoán nhanh đồng thời các tác nhân virus gây bệnh tai xanh (PRRS), dịch tiêu chảy cấp (PED), dịch tả lợn (CSF) và bệnh lợn còi cọc do circo virus (PCV2) bằng kỹ thuật LAMP ứng dụng trong giám sát dịch bệnh ở địa phương

Sau một thời gian triển khai thực hiện, nhóm đề tài đưa ra những kết luận như sau:

1. Đã thiết kế được 24 mồi cho phản ứng LAMP phát hiện bốn loại virus PRRSV, CSFV, PEDV, PCV2 và phát hiện PRRSV và CSFV độc lực;

2. Xác định được hàm lượng các chất cho phản ứng LAMP 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4) 2SO4, 8 mM MgSO4 và 0,1% Triton X-100, betaine 0,8 M, hỗn hợp dNTP 1,0 mM, 8U Bst 3 DNA Polymerase;

3. Tìm được 3 phương pháp tách chiết đồng thời virus RNA và DNA từ các mẫu bệnh phẩm là QIAamp CADOR PATHOGEN MINI KIT, Viral Gene-spinTM Viral DNA/RNA Extraction Kit và E.Z.N.A.® Universal Pathogen Kit;

4. Tạo được 6 đối chứng dương;

5. Xác định được thông số tối ưu hóa với nồng độ mồi ngoài (BW, FW) là 0,2µM, mồi trong (BIP, FIP) là 0,8µM, thời gian 60 phút và nhiệt độ 63oC cho phản ứng LAMP phát hiện virus PRRS, CSF, PED và PCV2;

6. Xây dựng một bảng hướng dẫn chi tiết phản ứng RT, phản ứng LAMP và phương pháp đọc kết quả. Thiết kế hộp đựng KIT chứa 13 thành phần cho phản ứng;

7. Giới hạn cho việc phát hiện gen đích của LAMP ở nồng độ 0,1ng/µl và không có sản phẩm LAMP với các mồi khác gen đích;

8. Thời hạn bảo quản KIT LAMP ở 4°C (trong 4 ngày); -20oC (12 tháng); -30oC (18 tháng);

9. Quy trình sản xuất KIT, Quy trình sử dụng KIT và Quy trình bảo quản KIT đã được công nhận tại cấp cơ sở;

10. Đã sản xuất 36 KIT gồm 1080 phản ứng và KIT được công nhận TBKT;

11. Thu thập được 424 mẫu phân và mẫu swab trực tràng tại các địa phương: Quảng Ninh, Phú Thọ, Thái Nguyên, Yên Bái, Thái Bình và Sóc Sơn và 1 mẫu vắc-xin đông khô dịch tả lợn;

12. Đã xét nghiệm 425 mẫu (85 mẫu gộp) trong đó có 3 mẫu gộp dương tính với CSFV, 5 mẫu gộp dương tính PRRSV, 6 mẫu gộp dương tính PEDV và 4 mẫu dương tính PCV2;

13. KIT LAMP có độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác đối với mẫu thu thập tại thực địa từ 95,5-100%, 97,2 - 98,4% và 96,7-98,33;

14. KIT LAMP vẫn còn một số nhược điểm như đọc kết quả bằng mắt thường độ chính xác không cao, dễ tạp nhiễm hay khó thực hiện tại thực địa;

Bên cạnh những kết quả thu được, Đề tài kiến nghị cần có một số nghiên cứu sâu hơn nữa để loại bỏ một số nhược điểm của kỹ thuật LAMP.

Như vậy, Đề tài được triển khai là điều kiện để cập nhật, bồi dưỡng, nâng cao những kiến thức về kỹ thuật sinh học phân tử mới cho đội ngũ cán bộ nghiên cứu và cán bộ thú y cơ sở trong quá trình phát triển chương trình nông nghiệp công nghệ cao ở Việt Nam. Nhóm đề tài xây dựng được quy trình sản xuất KÍT chẩn đoán dựa trên kỹ thuật tái bản đằng nhiệt (Loop mediated isothemal amplification). Đây là một công nghệ mới trong việc phát triển các KIT chẩn đoán nhanh, đặc hiệu và tiện dụng có thể áp dụng cho nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong chẩn đoán sàng lọc mẫu giám sát hàng năm ở các Chi cục Chăn nuôi và Thú y. Đề tài đã phát triển thành công KIT sàng lọc phát hiện nhanh cùng lúc cả bốn loại virus trong cùng một mẫu bệnh phẩm là mẫu phân hoặc mẫu swab nên giảm được chi phí, thời gian và thuận tiện cho việc lấy mẫu và xét nghiệm mẫu trong công tác giám sát dịch bệnh hàng năm tại các Chi cục Chăn nuôi và Thú y các tỉnh.

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài (Mã số 18460/2020) tại Cục Thông tin khoa học và công nghệ quốc gia.

P.T.T (NASATI)